病毒引發(fā)感染是通過注射它們自己的遺傳物質(zhì)。自上世紀(jì)70年代以來，科學(xué)家們就已經(jīng)開始運(yùn)用病毒的這一特性：利用病毒載體運(yùn)送DNA到細(xì)胞中，用于研究、基因療法等。

        然而，構(gòu)建病毒載體其實(shí)是一個(gè)非常艱苦、昂貴的過程，臨床級(jí)載體(clinical-grade vectors)的短缺還導(dǎo)致了基因療法和細(xì)胞療法的生產(chǎn)瓶頸。此外，即使是可用的，病毒載體也遠(yuǎn)不是一種理想的工具，因?yàn)樗鼈儠?huì)將基因隨意插入到細(xì)胞基因組中，這將損害現(xiàn)有的健康基因或使新引入的基因不受確保細(xì)胞正常運(yùn)作的調(diào)節(jié)機(jī)制的控制。這些局限性可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，已經(jīng)引起了人們對(duì)基因療法和細(xì)胞療法(如CAR-T)的擔(dān)憂。

        圖片來源：Nature

        擺脫“病毒”的新技術(shù)

        7月11日，發(fā)表在Nature雜志上題為“Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting”的研究中，來自加州大學(xué)舊金山分校(UCSF)的科學(xué)家們開發(fā)出了一種在不使用病毒插入DNA的前提下就能“重寫”人類T細(xì)胞基因組的強(qiáng)大技術(shù)。

        具體來說，該技術(shù)依賴于電穿孔：將一個(gè)電場(chǎng)應(yīng)用于細(xì)胞，使得細(xì)胞膜暫時(shí)具有更大的滲透性。經(jīng)過一年的探索，UCSF的Alex Marson博士帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一定數(shù)量的T細(xì)胞、DNA和CRISPR被混合在一起，然后暴露于適當(dāng)?shù)碾妶?chǎng)后，T細(xì)胞能夠整合特定的基因序列到基因組中被CRISPR切割的位點(diǎn)。

        Alex Marson, MD, PhD, UCSF immunologist whose group has developed an approach to edit T cell genomes without using viruses, speaks with MD/PhD student Theo Roth. Credit: Noah Berger.

        事實(shí)上，Marson博士實(shí)驗(yàn)室的成員先前已經(jīng)在利用電穿孔和CRISPR插入少量遺傳物質(zhì)到T細(xì)胞中取得了一定程度的成功。但大量嘗試將長(zhǎng)的DNA序列插入到T細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)都失敗了：導(dǎo)致了細(xì)胞死亡。這使得很多研究人員認(rèn)為，大的(長(zhǎng)的)DNA序列對(duì)T細(xì)胞毒性過大。

        為了展示新技術(shù)的多功能性和實(shí)力，Marson博士等利用它修復(fù)了T細(xì)胞中的一種致病基因突變，并且創(chuàng)造出了能夠找到和殺死人類黑色素瘤細(xì)胞的“定制T細(xì)胞”。

        據(jù)論文第一作者Theodore L. Roth介紹，科學(xué)家們嘗試將新基因插入T細(xì)胞已有30年之久。在他們的研究中，經(jīng)過近一年的反復(fù)試驗(yàn)，Roth確定了T細(xì)胞數(shù)量、DNA數(shù)量和CRISPR豐度(CRISPR abundance)的比值，結(jié)合擁有適當(dāng)參數(shù)的電場(chǎng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)T細(xì)胞基因組高效、準(zhǔn)確的編輯。

        The research team created CRISPR guides that would cause green fluorescent protein to be expressed in only certain cellular locations and structures. Credit: Alex Marson's Lab.

        “實(shí)力”驗(yàn)證

        研究中，Roth首先設(shè)計(jì)CRISPR用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標(biāo)記一組不同的T細(xì)胞蛋白，結(jié)果證實(shí)，新技術(shù)具有高度的特異性，且脫靶效應(yīng)水平非常低：GFP只在特定的細(xì)胞位置和結(jié)構(gòu)中表達(dá)。

        接著，他們開始驗(yàn)證新技術(shù)的治療前景。在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，Roth及其同事使用了由耶魯醫(yī)學(xué)院Kevan Herold提供給Marson博士實(shí)驗(yàn)室的T細(xì)胞。這些細(xì)胞來自患罕見、嚴(yán)重自身免疫性疾病的三個(gè)兄弟姐妹�；�因組測(cè)序顯示，這些兒童的T細(xì)胞攜帶著IL2RA基因的突變。而IL2RA基因編碼的是對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs，可抑制其他免疫細(xì)胞，阻止自身免疫)發(fā)育至關(guān)重要的一種細(xì)胞表面受體。

        利用基于CRISPR的新技術(shù)，UCSF的團(tuán)隊(duì)快速修復(fù)了兒童T細(xì)胞中的IL2RA缺陷，以及因突變受損的細(xì)胞信號(hào)。研究人員希望，就像利用CAR-T療法抗癌一樣，類似的技術(shù)能夠有效治療自身免疫性疾病。

        在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中，借助新技術(shù)，科學(xué)家們用“被專門設(shè)計(jì)用于識(shí)別人類黑色素瘤細(xì)胞特殊亞型的新受體”完全取代了“正常人類T細(xì)胞中的天然T細(xì)胞受體(T cell receptors，細(xì)胞用于檢測(cè)疾病和感染的傳感器)”。在培養(yǎng)皿中，被改造過的T細(xì)胞表現(xiàn)出了特異性：不僅能夠有效地找到目標(biāo)黑色素瘤細(xì)胞，同時(shí)還會(huì)忽略其他細(xì)胞。這對(duì)于癌癥精準(zhǔn)治療是非常重要的。

        研究人員強(qiáng)調(diào)，在不使用病毒載體的情況下，他們能夠生產(chǎn)出大量經(jīng)CRISPR改造后表達(dá)新T細(xì)胞受體的工程細(xì)胞。而將這些CRISPR工程細(xì)胞(CRISPR-engineered cells)移植給攜帶人類黑色素瘤的小鼠后，它們能夠進(jìn)入腫瘤部位，并顯示出抗癌活性。

        Set of test tubes in Alex Marson's lab. Credit: Noah Berger.

        前景廣闊

        Roth表示，由于新技術(shù)使得“在一周多一點(diǎn)的時(shí)間內(nèi)創(chuàng)建可用的定制T細(xì)胞系”成為了可能，因此，它已經(jīng)改變了Marson博士實(shí)驗(yàn)室的研究環(huán)境。先前一些受限于病毒載體的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)在可以進(jìn)行了。

        “這是一種能夠用于改變、增強(qiáng)以及重編程T細(xì)胞的快速、靈活的方法。與速度和易用性一樣重要的是，新技術(shù)使得‘將大量的DNA片段插入T細(xì)胞中’成為了可能，這將賦予T細(xì)胞強(qiáng)大的新特性。”Marson博士評(píng)價(jià)道。

        總結(jié)來說，研究人員希望，他們的新技術(shù)——一種基于CRISPR的快速、全能、經(jīng)濟(jì)的方法能夠在新興的細(xì)胞治療領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，加速開發(fā)新的、更安全的癌癥、自身免疫性疾病和其他疾病(包括罕見的遺傳性疾病)的治療方法。

        原始出處：

        Theodore L. Roth, Cristina Puig-Saus, Alexander Marson, et.al.Reprogramming human T cell function and specificity with non-viral genome targeting.Nature 11 July 2018