中國學(xué)者在ADA舞臺上傳遞的“中國之聲”亦是大會看點之一。下面讓我們先來看看來自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院曾文博士代表曾龍驛教授團隊分享的“改善誘導(dǎo)的胰島β細胞和功能障礙”報告。

        摘要

中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院曾文博士

        脂毒性導(dǎo)致的胰島素分泌功能障礙是2型糖尿病發(fā)病的重要原因之一。因此，保護胰腺β細胞的數(shù)目和功能是糖尿病研究的長期目標(biāo)。以往研究表明，膜蛋白中小凹蛋白1(Caveolin-1)與β細胞凋亡和胰島素分泌有關(guān)，但其中機制仍不清楚。本研究的目的是探討Cav-1沉默是否保護脂毒性下的胰腺β細胞及潛在機制。我們研究發(fā)現(xiàn)，Caveolin-1(Cav-1)沉默可以顯著促進β細胞增殖，抑制棕櫚酸酯(PA)誘導(dǎo)的胰腺β細胞凋亡并增強胰島素的產(chǎn)生和葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)。這些作用與其激活A(yù)kt和ERK1/2、抑制細胞周期抑制分子(FOXO1，GSK3β，P21，P27和P53)的表達并促進Cyclin D2和Cyclin D3的表達有關(guān)。隨后，通過抑制PI3K/Akt和ERK/MAPK信號通路阻斷了Cav-1沉默對β細胞數(shù)目的保護作用。而且，PA可以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激，但Cav-1沉默后顯著降低了eIF2α磷酸化和ER應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)志物BiP和CHOP的表達，而這些標(biāo)志物可以增強細胞對脂毒性的敏感性。此外，通過電鏡觀察到Cav-1沉默改善了脂毒性下的自噬功能障礙，這個現(xiàn)象與其引起Lc3b mRNA、LC3-II和LC3-II/LC3-I蛋白的表達上調(diào)、p62表達下調(diào)以及mTOR通路被抑制的結(jié)果相一致。我們的研究結(jié)果表明，Cav-1沉默可以降低脂毒性誘導(dǎo)的β細胞凋亡和改善胰島素分泌功能障礙。因此，Cav-1可能作為未來T2DM治療中潛在的靶點。

        專家點評

中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院曾龍驛教授

        關(guān)鍵點1:Cav-1沉默促進了胰島β細胞的增殖和胰島素產(chǎn)生

        為了確定Cav-1沉默是否影響NIT-1細胞和小鼠胰島細胞的增殖，我們進行了ki-67免疫熒光染色實驗。結(jié)果顯示，PA的處理顯著抑制了NIT-1細胞和小鼠胰島細胞增殖，而不管有或沒有0.5mM的PA處理，沉默Cav-1均可促進NIT-1細胞和胰島細胞的增殖。同時，PA處理抑制了NIT-1細胞和胰島中Cyclin D2和Cyclin D3的表達水平。而沉默Cav-1后，無論有否PA處理，NIT-1細胞和胰島中的Cyclin D2和Cyclin D3的表達顯著增加。以上這些結(jié)果表明，沉默Cav-1的的NIT-1細胞和胰島均具有更高的增殖活性。由于正常的小鼠胰島增殖效率非常低，所以Cav-1沉默誘導(dǎo)的β細胞增殖有一定的價值。

        研究表明，長期暴露在PA環(huán)境下可以導(dǎo)致胰腺β細胞功能障礙。我們隨后研究了Cav-1沉默在胰島素分泌中的作用。結(jié)果表明，無論有否PA處理，Cav-1沉默組與對照組相比，胰島素mRNA表達和胰島總胰島素含量升高均超過2-3倍。

        關(guān)鍵點2:Cav-1沉默抑制了PA誘導(dǎo)的胰島β細胞的GSIS功能失調(diào)和凋亡

        此外，我們發(fā)現(xiàn)PA處理可以增加基礎(chǔ)條件下的胰島素分泌，但對16.7mM葡萄糖刺激無反應(yīng)，說明PA處理引起了GSIS功能障礙，胰島對葡萄糖濃度的變化敏感性下降。但是，Cav-1沉默成功逆轉(zhuǎn)了PA引起的高濃度葡萄糖刺激下的胰島素分泌功能障礙，并且在GSIS測定中仍然保持了2倍以上的胰島素分泌增加量�？傊�，這些結(jié)果表明Cav-1沉默可以改善PA刺激下的胰島的胰島素分泌功能障礙。

        另外，通過流式細胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，PA處理可以顯著增加NIT-1細胞凋亡，而敲除Cav-1后，細胞凋亡明顯減少。同樣的結(jié)果也在Hoechst 33342/PI染色法和TUNEL染色法中被證實。此外，PA處理引起的caspase3剪切體的增加也被Cav-1沉默顯著抑制。這些結(jié)果表明，Cav-1沉默可以抑制PA誘導(dǎo)的胰腺β細胞凋亡。

        為了研究Cav-1沉默促進β細胞增殖、胰島素分泌和抑制其凋亡的潛在機制，我們檢測了Cav-1沉默后PI3K/Akt、ERK/MAPK通路以及細胞周期抑制蛋白在有或沒有PA處理下的變化。結(jié)果表明，Cav-1沉默顯著促進了PA刺激下的Akt和ERK的磷酸化。隨后，我們通過相應(yīng)通路的抑制劑來阻斷Akt和ERK1/2磷酸化則消除了Cav-1沉默對β細胞的促增殖活性。且PA刺激促進了細胞周期抑制子(FOXO1，GSK-3β，P21，P27和P53)的表達，而Cav-1沉默顯著抑制了細胞周期抑制子的表達。這些結(jié)果均表明，Cav-1沉默通過調(diào)控PI3K/Akt、ERK/MAPK通路和細胞周期相關(guān)蛋白，促進β細胞增殖，降低PA誘導(dǎo)的凋亡。

        關(guān)鍵點3:Cav-1沉默降低了PA誘導(dǎo)的胰島β細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

        研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以導(dǎo)致胰腺β細胞功能障礙和細胞凋亡。因此，我們研究了在有或沒有PA處理的情況下，Cav-1沉默和ER應(yīng)激的關(guān)系。通過對ER應(yīng)激標(biāo)記分子(BiP，XBP-1s，ATF4和CHOP)表達和eIF2α磷酸化的分析，我們發(fā)現(xiàn)PA處理激活了NIT-1細胞和原代胰島中ER應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，顯著上調(diào)了NIT-1細胞和胰島中的ER應(yīng)激標(biāo)記分子的表達，并且促進了NIT-1細胞的eIF2α的磷酸化。但是，Cav-1沉默顯著降低ER應(yīng)激標(biāo)記分子和eIF2α的磷酸化。這些數(shù)據(jù)表明，Cav-1沉默減輕了PA誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，這可能參與了其保護胰腺β-細胞功能障礙和細胞凋亡的作用。

        關(guān)鍵點4:Cav-1沉默改善了PA誘導(dǎo)的胰島β細胞自噬功能障礙

        自噬缺陷與胰腺β細胞的數(shù)量減少和功能障礙有關(guān)。我們的電鏡結(jié)果顯示，0.25 mM的PA刺激下的NIT-1表現(xiàn)為自噬小體增加，溶酶體和自噬溶酶體缺如，自噬功能失調(diào)。高脂刺激下，沉默Cav-1的NIT-1細胞與對照組比較，溶酶體正常，且自噬小體與自噬溶酶體均正常形成，自噬調(diào)控過程正常。

        進一步對調(diào)控自噬的關(guān)鍵分子的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PA可以引起NIT-1細胞株和原代胰島的Lc3b、LC3-II和LC3II/I的蛋白水平顯著上調(diào)。但PA刺激同時引起了自噬后期底物p62降解障礙，表現(xiàn)為NIT-1細胞株和原代胰島中自噬底物p62分子累積，說明PA刺激下，自噬后期出現(xiàn)了功能障礙，不能正常完成自噬-溶酶體過程以降解有毒物質(zhì)。另一方面，調(diào)控自噬的關(guān)鍵信號通路mTOR，在PA刺激下被顯著促進，導(dǎo)致下游Beclin-1轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，從而影響自噬調(diào)控。而沉默Cav-1則表現(xiàn)為更高水平的Lc3b、LC3-II和LC3II/I的表達水平。且PA誘導(dǎo)的自噬失調(diào)被有效控制，p62的累積在基因和蛋白水平均被顯著下調(diào)，說明自噬后期的功能障礙被改善。而PA引起的mTOR信號通路的激活也被有效抑制，引起下游Beclin-1的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，自噬被促進。總之，Cav-1沉默改善了PA刺激下的胰腺β細胞自噬功能障礙。