眾所周知，NGS 相比傳統(tǒng)的檢測技術(shù)，如 QPCR 和 Sanger 測序等，有著明顯的通量優(yōu)勢(shì)，可在一次檢測中對(duì)上百萬甚至數(shù)十億個(gè) DNA 分子進(jìn)行大規(guī)模重測序，從而給出更為全面的疾病基因譜，使精準(zhǔn)診療成為可能，也有助于發(fā)現(xiàn)一些未知的疾病相關(guān)基因變異。
隨著其技術(shù)的日趨成熟和成本降低，近年來，NGS 已被大規(guī)模推向了臨床應(yīng)用，尤其是在腫瘤臨床實(shí)踐中，被用來進(jìn)行腫瘤驅(qū)動(dòng)基因測序、靶向用藥指導(dǎo)、腫瘤分子分型和精準(zhǔn)診療等，還有更多的早篩和復(fù)發(fā)監(jiān)測技術(shù)正在研發(fā)中。
不過 NGS 也因其技術(shù)較為復(fù)雜，影響因素較多，檢測內(nèi)容不一，數(shù)據(jù)分析和解讀有難度，國內(nèi)外都比較缺乏相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)等原因，進(jìn)一步規(guī)范化 NGS 的臨床應(yīng)用成為了挑戰(zhàn)。在這個(gè)背景下，2018 年 7 月 10 日，由中華醫(yī)學(xué)會(huì)主辦的《中華醫(yī)學(xué)雜志》在線發(fā)表了題為《二代測序技術(shù)在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用專家共識(shí)》（以下簡稱《共識(shí)》）的最新文章，系統(tǒng)地闡述了 NGS 技術(shù)質(zhì)量需求、臨床腫瘤相關(guān) NGS 檢測內(nèi)容、樣本處理、測序流程、數(shù)據(jù)管理、信息學(xué)分析、結(jié)果報(bào)告解釋和咨詢等方面的內(nèi)容。
在樣本的采集和處理方面，《共識(shí)》指出適合臨床 NGS 分析的樣品類型包括新鮮組織，甲醛固定 - 石蠟包埋（FFPE）組織，腫瘤細(xì)胞學(xué)標(biāo)本及血漿（游離 DNA/RNA）等，但不管什么樣本類型，都應(yīng)對(duì)抽提后和文庫構(gòu)建后的核酸樣本進(jìn)行質(zhì)控（聲明 11），關(guān)鍵點(diǎn)如下：
- 組織和血漿游離核酸的檢測前質(zhì)量控制分析，包括濃度和純度分析
- 組織 DNA 應(yīng)進(jìn)行核酸完整性分析，以判斷 DNA 質(zhì)量
- 游離 DNA 應(yīng)進(jìn)行片段長度分布分析，以判斷是否存在血細(xì)胞基因組 DNA 污染
- 文庫構(gòu)建后，應(yīng)對(duì)文庫濃度與片段長度分布進(jìn)行質(zhì)量控制
NGS 的一個(gè)主要的挑戰(zhàn)在于：在樣本制備過程中，怎樣保證起始量低、質(zhì)量參差的樣本，有一致的建庫成功率。核酸質(zhì)量的高低對(duì)于 NGS 測序結(jié)果的影響非常大，尤其在 FFPE 組織樣本中，核酸降解的現(xiàn)象非常普遍，分子完整性較差，可被測序的模板含量較低，如果未經(jīng)質(zhì)控的樣品按照統(tǒng)一的常規(guī)流程去操作，極易造成文庫產(chǎn)量過低，PCR 重復(fù)率和偏好性指標(biāo)升高等問題。前者會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)量不足，測序失敗，而后者會(huì)直接造成核酸分子的多樣性降低，與原始模板的偏差變大，從而導(dǎo)致檢測靈敏度和特異性的降低，產(chǎn)生假陰或假陽性結(jié)果。
在血漿樣品的檢測中，由于 cfDNA（游離 DNA）或 ctDNA（循環(huán)腫瘤 DNA）的含量非常有限，血細(xì)胞 gDNA（基因組 DNA）的釋放或在核酸處理過程中引入的 gDNA 污染，都會(huì)顯著降低 cfDNA 或 ctDNA 的濃度，不僅可能產(chǎn)生和上述 FFPE 樣品一樣的問題，還可能因?yàn)槠鋽y帶的重要疾病基因信息被無意義的基因組數(shù)據(jù)干擾，給數(shù)據(jù)分析和解讀增加難度。
過去，樣品質(zhì)控環(huán)節(jié)比較容易被忽視，或者存在一些誤區(qū)。比較典型的誤區(qū)是采用分光光度法或特異性熒光定量的方法來檢測核酸分子的濃度。但其實(shí)這些方法只能檢測核酸分子的濃度，卻無法判斷核酸的降解程度，更不能評(píng)價(jià)基因組 DNA 的污染，故不能滿足《共識(shí)》的要求。
更為適合的樣品質(zhì)控技術(shù)是基于 QPCR 的定量方法，如 KAPA hgDNA 定量和質(zhì)控試劑盒 （通用型）產(chǎn)品（KK4960），針對(duì)人類基因組中的高保守區(qū)位點(diǎn)設(shè)計(jì) 3 種不同長度片段的 PCR 引物，分別用于檢測小片段、中片段和大片段的含量，并基于他們的相對(duì)比例來評(píng)估樣品的降解程度，不僅可準(zhǔn)確定量可測序分子的濃度，更同步完成了片段大小 + 片段完整性的分析，一舉多得。該方法同樣適合評(píng)估游離核酸樣品的質(zhì)量和純度，大多數(shù) cfDNA 和 ctDNA 的片段長度都介于 100-200bp 之間，因此，對(duì)于純度較高的樣品，原理上不應(yīng)擴(kuò)增出大片段產(chǎn)物，但若樣品中混有基因組 DNA 污染時(shí)，就會(huì)很容易擴(kuò)增出大片段產(chǎn)物，根據(jù)其絕對(duì)含量，即可評(píng)估初始樣品中的污染程度。值得注意的是，NGS 測序反應(yīng)本質(zhì)上也是一種特殊的 PCR 反應(yīng)，所以應(yīng)用 QPCR 技術(shù)進(jìn)行檢測，更能準(zhǔn)確地反映出可被測序的模板含量，而不是所有核酸模板的含量，因此比分光光度法或熒光定量方法更為準(zhǔn)確。當(dāng)然，使用 QPCR 之前也需事先驗(yàn)證 PCR 體系的聚合酶活性和擴(kuò)增偏好等性能指標(biāo)。
圖 1：人類基因組 DNA 定量及 QC 檢測原理。一組 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品使用 3 對(duì)不同引物用于產(chǎn)生 3 組標(biāo)準(zhǔn)曲線。這 3 對(duì)引物的擴(kuò)增目標(biāo)位于人類基因組某高度保守的、單拷貝的區(qū)域，片段大小分別為 41 bp，129 bp 和 305 bp。41 bp 檢測用于 DNA 樣品的絕對(duì)定量，129 bp 和 / 或 305 bp 用于片段大小和完整性評(píng)估。由于低質(zhì)量的 DNA 樣本的長片段擴(kuò)增效率會(huì)大幅度降低，因此其降解程度可以通過 41 bp 檢測的濃度對(duì)于 129 bp 或者 305 bp 檢測的濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理來進(jìn)行推測，并用標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)量分?jǐn)?shù)（Q 值，介于 0 - 1 之間）進(jìn)行量化評(píng)價(jià)。
文庫構(gòu)建后，上機(jī)測序之前，為了最大化測序經(jīng)濟(jì)性，平衡不同文庫混合后的通量均勻性，往往需要進(jìn)行文庫定量質(zhì)控。而合格的文庫定量亦如上述，需要采用適合的檢測技術(shù)才能保障測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于接頭連接反應(yīng)效率、文庫擴(kuò)增效率和接頭聚合體等諸多問題，采用分光光度法或熒光定量法同樣因?yàn)槠涠吭淼木窒扌�，無法排除上述干擾，導(dǎo)致定量高估或低估，進(jìn)而造成測序數(shù)據(jù)不足或冗余，所以采用基于 QPCR 的文庫定量方法仍是目前的“金標(biāo)準(zhǔn)”。
圖 2：基于 QPCR 文庫定量能高準(zhǔn)確度地定量所有可測序分子。文庫制備流程中，DNA 插入片段和連接接頭會(huì)產(chǎn)生很多連接情況，除了兩端皆連接上接頭的分子可以被測序外，還有一些連接情況（單端連接或未連接）不支持后續(xù)的成簇?cái)U(kuò)增，不能被測序。QPCR 法僅檢測接頭連接正確的分子，這對(duì)于質(zhì)控的有效性是特別關(guān)鍵的。分光光度法、熒光法和電泳法都只能檢測所有的雙鏈分子，且無法評(píng)估接頭的連接情況。文庫擴(kuò)增后，有時(shí)過度的擴(kuò)增會(huì)導(dǎo)致引物消耗殆盡，但變性和退火仍在進(jìn)行，這些過程會(huì)產(chǎn)生不完全退火的部分雙鏈、部分單鏈的 DNA 異構(gòu)體。此時(shí)，采用 dsDNA 結(jié)合染料的電泳法和熒光法僅能檢測完整的雙鏈 DNA 片段，導(dǎo)致對(duì)過度擴(kuò)增文庫定量的低估。
綜上所述，好的樣品質(zhì)控管理是產(chǎn)生符合臨床要求的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)的大前提。《共識(shí)》不僅首次明確了質(zhì)控流程對(duì)于規(guī)范化 NGS 樣品制備的重要性，還就進(jìn)行質(zhì)控和評(píng)價(jià)的方法給出了具體指導(dǎo)意見，這一進(jìn)步實(shí)在意義重大。